在定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法,光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值,Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是最新的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。
数字PCR(Digital PCR)仪器应用领域:
癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析以卓越的灵敏度和准确度测量癌症突变的变异程度、
检测稀有的 DNA 靶拷贝以及解析拷贝数变异状态。
病原体检测
精确地对靶 DNA 或 RNA 分子中的细微变化进行定量分析,从而检测和监测病原体。
与新一代测序 无缝对接
无需使用标准曲线,直接对 NGS 库执行绝对定量分析。
基因表达分析
可对少量 mRNA 和 miRNA 的细微变化进行准确及重复性极佳的检测。
环境监测
使用 QX200 系统可测试多种环境样品,例如土壤和水。
食品检测
采用经过验证的 ddPCR 方法对转基因生物体 (GMO) 进行评估。
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