抗HPV生物蛋白敷料JB01-BD阴道内用药改善高危HPV感染的

随机开放性临床试验

摘要：目前，国内外仍缺乏针对HPV感染的特异性抗病毒疗法。通过随机开放性临床试验，我们检测了中国山西锦波生物医药股份有限公司生产的抗HPV生物蛋白敷料JB01-BD对HPV感染的治改善果。试验中，77位高危HPV阳性的受试女性患者被随机分成改善组和非改善组。试验结束后，在JB01-BD改善组中约60.5%（23/38）的女性HPV病毒载量转阴，而在对照组中仅有13.5%的患者转阴（5/37）（P＜0.001）。临床研究结果证实JB01-BD是改善HPV感染的一种有效的局部用生物制剂。

1. 背景介绍

宫颈癌是女性第四大常见的癌症，全球每年死于宫颈癌的人数超过266,000人。80%的宫颈癌发生在发展中国家，在这些国家里，宫颈癌是造成15-44周岁女性第二高死亡率的癌症类型。在中国，每年约有135,000名女性发展成宫颈癌，因之丧生的人数也高达50,000人。这些数据表明宫颈癌的发生率正呈现快速增长的趋势，严重威胁女性健康。因此，开发预防宫颈癌的安全有效的生物制剂迫在眉睫。

我们已知高危人乳头瘤病毒（HPV）是引发宫颈癌的元凶，其致病机制目前已较为清楚。HPV是一种无包膜双链小DNA病毒，其基因组可分为三个区域：E区域（包含早期基因E1-E7），L区域（包含晚期基因L1和L2），以及LCR区域（长控制区）。HPV常被分为高危型和低危型两种类型，可以感染口腔、手足和生殖器等器官的上皮细胞或粘膜组织。当皮肤或粘膜受损，HPV病毒颗粒可以穿透人体物理屏障，直接与上述组织基底细胞接触。因此，HPV病毒的生存周期为阻止HPV感染、预防宫颈癌发生提供了最好的干预机会。迄今为止，市场上还没有特异性针对HPV感染的抗病毒改善方法。HPV疫苗在很多国家被批准上市，但包括中国在内的很多发展中国家还没有开始使用这类疫苗，主要是因为这类疫苗价格高昂，且预防的HPV亚型种类有限。因此，亟待开发出特异性预防和改善HPV感染的有效制剂。

科学研究发现，酸酐化蛋白针对许多病毒都具有广谱的抗病毒活性。其中，3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的牛β-乳球蛋白对高危型和低危型HPV感染都显示出高效的抗病毒作用。此外，该制剂价格适中，且在溶液中高度稳定，很容易制成局部用凝胶制剂。

最近，中国太原市山西锦波生物医药股份有限公司将这种化学修饰蛋白（名称为JB01）制作成生物敷料产品（缩写为JB01-BD）。本文中，我们利用随机开放性临床试验，评估了JB01-BD在高危HPV阳性的女性患者中临床治改善果。

2. 材料与方法

2.1 材料

JB01-BD，包含0.01%的JB01（化学修饰的牛β-乳球蛋白）溶于生物敷料，来自山西锦波生物医药股份有限公司。JB01-BD的生产遵循药品生产质量管理规范（GMP）。生物敷料的主要成分为2%的卡波姆（Carbomer）和2.5%的甘油，这两种成分在美国食品药品管理局的规定中认定为安全无毒性的药用添加剂。根据中国HPV感染改善规范，目前没有其他可使用的替代药物作为本实验的对照组。而且，通过尝试发现无法制作出不含JB01有效成分但与JB01-BD外形感觉都完全相同的安慰剂对照品。因此，本试验中的对照组定为不接受任何改善。

2.2 受试者

本试验已得到参与医院的伦理委员会批准。所有受试者均需签订书面知情同意书，纳入标准如下：25-65岁感染高危HPV的女性患者，感染HPV类型为16,18,31,33,35,39,45,51,52, 56,58,59和68，且无高级别宫颈病变。排除标准如下：对产品各组分过敏，肝肾功能异常，肿瘤恶化，免疫缺陷，阴道炎症（滴虫、霉菌或细菌感染），患有性病或其他影响试验进行的疾病（依医生的临床经验判定）。临床试验选取非经期、非孕期、非哺乳期患者。受试者均自愿参与本试验，并在试验前签署知情同意书。

2.3 试验设计

为评估JB01-BD作为局部性药物改善宫颈部位感染不同高危HPV亚型的药效，我们选取中国两所医院开展随机开放性I/IIa阶段临床试验。试验在中国临床试验注册中心注册（注册号ChiCTR-TRC-12002016）。根据电脑随机编号系统生成相同样本量的两组种子数，将受试者随机分为改善组和对照组。改善前，根据HPV检测试剂盒说明书检测每位受试者的HPV病毒的DNA载量（HC2法，美国Digene公司）。宫颈阴道样品溶液的HPV病毒检测信号以相对光单位RLU表示，与试剂盒提供的阳性对照平均阳性信号值对比。RLU/CO值大于或等于1表示阳性，对应的浓度为1pg/ml。改善组的受试者接受JB01-BD（每剂量3g）改善，每隔一天宫颈涂抹一次，连续三个月，经期停用。非改善组在试验中不进行任何改善，随访观察。所有受试者每月随访，三个月后，再次测定HPV病毒的DNA载量。

2.4 数据分析

所有入组并随机分组的受试者均采用均值和频率计数方法描述。所有统计分析均使用SPSS（版本13.0）软件。组间差异分析采用Rank Sum法或Chi-square法进行。认为P值小于0.05为具有统计学差异。

3. 结果

3.1  受试者参与情况

本试验共纳入77名受试者，其中38名接受JB01-BD改善，39名未接受改善。其中改善组的38名受试者全部完成了整个改善过程，而非改善组中有37名受试者完成了试验过程，另外两名中途脱组。改善组与非改善组的年龄分布无统计学差异（P=0.479）。

3.2  JB01-BD能显著降低HPV感染女性的阳性率

从表1结果可见，改善组的38名受试者在接受JB01-BD改善后，15名（39.5%）仍显示HPV阳性（HPV病毒的DNA载量阳性），也就是60.5%的HPV阳性受试者在JB01-BD改善结束后，呈现HPV阴性。而非改善组的37名HPV感染者中仍有32名受试者呈现HPV阳性，只有13.5%的受试者体内的HPV由阳性转为阴性。组间统计学分析Chi-square结果为17.71，证明两组结果存在显著性差异（P＜0.001）。因此，我们的结果说明JB01-BD可以有效抑制HPV的感染和复制，使HPV感染患者转阴。

3.3  JB01-BD能显著降低HPV感染女性的DNA载量

采用HC2方法检测每名受试者的HPV DNA载量。如表2所示，试验前，改善组受试者HPV DNA平均载量为19.80 RLO/CO，非改善组该数值为13.16 RLO/CO。根据Rank sum测试，两组该结果无显著性差异（Z score=0.618；P=0.537）。但在试验后，两组受试者的所有检测指标均产生显著性差异（P＜0.001）。38名接受JB01-BD改善的受试者平均HPV DNA载量降到了0.76 RLU/CO（阴性），而非改善组的HPV DNA平均载量仍保持在高水平22.25 RLU/C（阳性）。改善组HPV DNA载量平均降低了88.42%，而非改善组平均升高了5.55%。

从表3可见，根据数值大小将HPV DNA载量可以分为5个级别：＜1（阴性）；1-9.9；10-99.9；100-999.9；≧1000 RLU/CO。在试验前，每组受试者的HPV DNA载量均为阳性。而且在两组中，所有4个级别的受试者的数量分布也无显著性差异（χ²=1.227，P=0.746）。而在试验后，两组的5个级别受试者的分布产生了显著性差异（χ²=42.326，P＜0.001）。在JB01-BD改善组，38名受试者主要分布于低病毒载量级别，其中60.5%的受试者HPV DNA载量已低于1 RLU/CO（阴性）。而非改善组的37名受试者主要分布于高病毒载量级别（32.4%分布在10-99.9 RLU/CO级，24.3%分布在1-9.9 RLU/CO级）。因此，我们的结果证明应用JB01-BD改善可以显著降低HPV DNA载量，直至达到HPV DNA阴性。

4. 讨论

目前，尚未有上市的针对HPV感染的特异性抗病毒药物。手术切除、化学消融和冷冻改善等方法可以改善HPV感染引起的生殖器疣和宫颈癌等疾病，但如果HPV感染没被控制，这些疾病很可能反复。美国FDA授权的三种HPV预防性疫苗（卉妍康、加德西和加德西9）已被推荐给所有9-26周岁的女性使用，但对于26周岁以上的女性，这些疫苗不能有效预防HPV感染。此外，它们也无法改善已经感染HPV的女性患者。这三种疫苗还未能提供给包括中国在内的很多发展中国家。因此，研发改善和/或预防HPV感染的有效抗病毒药物迫在眉睫。

我们之前的研究证明JB01在体外可以阻止HPV进入靶细胞，机制可能是通过JB01表面的负电荷氨基酸与L1和/或L2蛋白的正电荷氨基酸的相互作用。但JB01通过阴道/宫颈涂抹的方式是否能够安全有效的改善高危HPV感染仍不清楚。在此我们利用随机开放性临床试验，在感染了高危HPV的女性患者中采用山西锦波生物医药股份有限公司生产的抗HPV生物蛋白敷料JB01-BD进行改善，并评估了此敷料对改善25-60周岁HPV感染女性的有效性和安全性。JB01-BD与口服类或静脉注射类抗病毒药物不同，它直接涂抹在阴道/宫颈壁上。这样JB01无法进入血液循环，因此不会造成系统性毒性。试验结果也证实，在这次为期3个月的随机临床试验中，38名受试者每隔一天采用JB01-BD（每剂量3g）阴道用药，整个过程并未发现该药物有明显的毒副作用。

上述临床结果证明，JB01-BD可以有效控制HPV感染，约60.5%（23/38）的HPV阳性患者在接受改善后呈现HPV阴性，而非改善组中只有13.5%（5/37）的患者由HPV阳性转为阴性（表1）。此外，JB01-BD也可以有效的降低HPV DNA载量。HPV阳性（或称HPV感染）定义为检测到HPV DNA载量≥1.00 RLU/CO，HPV阴性定义为HPV DNA载量＜1.00 RLU/CO。在我们的试验中，改善组受试者的平均HPV DNA载量由19.8 RLU/CO降到了0.76 RLU/CO，而非改善组的HPV DNA载量反而从13.16 RLU/CO上升到22.24 RLU/CO（表2）。尽管仍有39.5%的受试者在改善后仍显示HPV阳性，但她们体内的病毒载量已经显著低于非改善组的受试者（χ²=42.326，P＜0.001）（表3）。这说明JB01-BD改善HPV感染患者不仅可以显著降低HPV阳性率，还能有效降低HPV DNA病毒载量。因此，JB01-BD是一种抗HPV安全有效的改善性药物，同时也可以用于对HPV的预防。 

致谢

我们对参与本次临床试验的受试者表示深深的感谢，同时感谢中国人民解放军总医院的工作人员对受试者招募和数据分析的帮助。本试验由山西锦波生物医药股份有限公司赞助。JB01和JB01-BD的体外试验由主要感染性疾病国家重大专项基金支持。

附录A：补充材料

本文补充材料可在以下网址中查看http://dx.doi.org/10.1016/j.micinf.2015.10.004

利益冲突

陆路和姜世勃是相关专利的共同发明者，该专利为复旦大学和山西锦波生物医药股份有限公司共同享有。其他作者间均无利益冲突。

图表

表1：JB01-BD改善前后HPV感染女性HPV阳性率对比

表2：JB01-BD对于降低HPV感染女性的HPV DNA载量作用明显

表3：JB01-BD改善前后HPV感染女性宫颈部位HPV DNA载量变化

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